重慶純水設備解讀：水體中致病微生物分析檢測和風險控制技術
【重慶水處理設備網http://xqccscq.com/】水中的微生物水平（細菌、病毒、原蟲等）衡量水質平安的重要指標，水源性致病微生物通過飲水和直接接觸等途徑感染人體，存在傳達各類疾病的風險，關乎人群生命健康。由于致病微生物在環境水體中通常以較低濃度存在檢測過程中均需先對水樣進行前處置將其濃縮成較小的體積。本文介紹了可用于水體中致病微生物富集濃縮的富集培養、離心、過濾和磁性分離等前處理方法的研究進展，討論了不同前處理方法的優缺點和適用范圍，以實現水體中致病微生物的準確檢測，真實反映致病微生物在水體中的賦存狀況，為水體中致病微生物分析檢測和風險控制提供技術支撐。
研究背景
水是人類賴以生存的物質，但水中存在各類污染源會損害人類和動物的健康。水是污染病傳播流行的重要途徑之一。研究標明，水中的微生物尤其是致病微生物是介水污染病傳播的重要因素，主要包括細菌(霍亂弧菌、大腸埃希氏菌、彎曲桿菌和沙門菌等)病毒(諾如病毒、腸道病毒、甲型肝炎病毒和輪狀病毒等)和原蟲(隱孢子蟲、賈第鞭毛蟲、溶組織內阿米巴蟲和圓孢子蟲等)根據美國疾病預防控制中心疫情演講系統的數據，美國在1971至2020年期間因飲用水中致病微生物（包括14種細菌、3種病毒和5種原蟲）污染共引起675起疫情，累計造成497140人患病，276人死亡。歷史上霍亂弧菌曾引發多次世界范圍內的霍亂大流行；由沙門菌、志賀菌、大腸埃希氏菌等引起的細菌性腹瀉在發展中國家也十分常見；此外，過去各國研究者對軍團菌的研究都聚焦在噴泉水和空調冷卻水上，但近年來飲用水系統被軍團菌污染的事件也多有發生，2020年美國疾病預防控制中心辦公樓因在供水系統中發現軍團菌而被封閉。因此，通過水質檢測對環境水體及飲用水中的致病微生物開展風險排查至關重要。
目前水中致病微生物的規范檢測方法基本都基于培養法進行檢測，但是培養法因某些因素可能會導致細胞計數不完全，如微生物受到非致命性的傷害、微生物不可培養、生長溫度不適宜、生長周期滿意足、超越非自養的存在時間等。近年來，國內外基于不同的檢測原理研發了多種更加便利快速的檢測技術，如環介導等溫擴增技術（LA MP基于ATP生物熒光檢測、以及熒光定量PCR等。其中，分子生物學技術因具有高特異性和快速檢測的特點而逐漸得到廣泛應用，這些方法可快速對多種致病微生物進行高通量檢測，但在水體中的應用主要受限于三個因素：1水體中致病微生物存在水平較低；2存在抑制分子生物技術（如PCR干擾物質（如鹽度、腐殖酸）3游離核酸（死細胞釋放的核酸）耐久性，導致在隨后的分子檢測方法中呈現假陽性信號。因此，為了對水源性致病微生物進行更為準確靈敏的分析，采取適宜的前處理方法，對其進行有效的富集和凈化是非常有必要的目前，國內外僅對水體中腸道病毒的富集濃縮方法有相關報道，但對致病微生物富集濃縮方法相關研究進展的總結分析較少，本文總結了水體致病微生物前處理方法的最新研究進展，分析了不同方法的優缺點和應用特點，以期為致病微生物高效便利的方法研究與應用提供理論基礎和科學依據。 重慶實驗室純水設備
1富集培養法
富集培養法是采用培養的方法對水樣中目標微生物進行增殖，以達到富集的目的根據微生物呼吸類型，富集培養法可分為好氧培養與厭氧培養。但是大多數微生物（大多數細菌，霉菌，放線菌等）需要有氧條件下進行培養，培養的方法主要有：1固體培養法：培養基外表（如斜面與平板表面）完成微生物增殖培養；2液體培養法：把微生物接種到液體培養基中進行增殖培養。Wang等開發了經過10~24h培養后用PCR檢測水中大腸埃希氏菌和腸球菌的方法，檢出限可達到0.2MPN/mLStrakova等通過一種基于離心、細菌運動和選擇性培養條件的新型培養方法對廢水和地表水中的耐熱彎曲桿菌進行分離，44%樣品中檢出彎曲桿菌陽性。從現有的研究來看，富集培養法在致病菌的富集濃縮中應用較多，對病毒和原蟲的富集濃縮常采用的雞胚及雞胚器官培養和細胞培養的體外培養模型，但這種方法目前主要應用于藥物的開發，水體中的應用較少。
鑒于細菌培養過程中大部分選擇性培養基只能培養特定的目標菌株，無法滿足多種致病菌高通量檢測的需求，目前開發多重選擇性培養液以實現多種致病菌的同時培養成為了一個新的研究熱點。Suo等開發了一種可以同時培養大腸埃希氏菌O157H7沙門菌屬和單核細胞增生李斯特氏菌3種致病菌的SEL培養液，100~102CFU/mL接種濃度下，三種目標菌株經過1h非選擇性恢復期再37℃選擇性培養20h后均可富集到108~109CFU/mLQu等開發了一種可以同時培養沙門菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌 O157:H7和單核細胞增生李斯特菌的SSEL培養液，101~102CFU/mL接種濃度下四種目標菌體37℃培養18h后均可富集到105CFU/mL
富集培養法的優點是可以選擇性培養目標菌株，同時可排除死菌和其他雜質的干擾（如非目標微生物、腐殖質等）但該方法培養過程耗時且只適用于可培養的細菌或真菌的富集，限制了其在致病微生物檢測的前處置過程中的研究和應用。
2離心法
基于離心的前處理方法是利用離心力使大小、形狀、密度和介質粘度不同的顆粒從液體介質中分離出來，分子生物學實驗室中最常用的技術之一，主要包括直接離心法和密度梯度離心法。 重慶純水設備
2.1直接離心法
直接離心法是直接對水中的微生物進行離心，通過將大部分微生物沉降于管底來達到分離及富集濃縮的目的根據目標微生物的大小不同可選擇不同的離心條件，原蟲體積較大，直徑＞3μm選用的離心力一般為（500~2000g細菌直徑一般為0.5~10μm常用的離心力范圍為（3000~12000rpm病毒直徑一般為0.01~0.1μm常用的離心力范圍為 90800~171000gBeheshtiMaal等以8000g離心10min后提取DNA 方法對伊朗伊斯法罕南部污水處置廠的進水水樣進行大腸埃希氏菌菌株的分離鑒定。生活飲用水規范檢驗方法》GB/T5750-2023采用Filta-MaxXpress快速方法對飲用水中賈第鞭毛蟲/隱孢子蟲進行測定時，采用的分離條件是2000g離心15minAhmed等對澳大利亞布里斯班某鄉村污水處置廠的進水水樣進行小鼠肝炎病毒測定時采用的分離條件是以100000g4℃下離心1h之后提取RNA 并結合RT-qPCR完成檢測，回收率為33.5± 12.1% 重慶純水設備
直接離心法的優點主要體現在以下幾個方面：
①方法本錢只涉及離心機的初始投資，使用中不需要化學試劑或其他高貴的消耗品；②速度快，可以在相對較短的時間內完成大體積水樣的處置；③方法操作簡單，技術要求低，操作過程中不會引入其他物質、試劑，對目標微生物影響較小。
直接離心法也存在缺乏之處：①在富集目標微生物的同時會對其他顆粒進行富集，特別是對于高濁度的水樣，容易對后續操作（如核酸提取、PCR檢測等）造成影響；②離心后傾倒上清液時易造成目標微生物損失。
2.2密度梯度離心法
密度梯度離心法是用一定的惰性介質（蔗糖、甘油等）離心管內形成連續或不連續的密度梯度，根據微生物在密度梯度液中的比重不同，通過離心力的作用使目標微生物分離的一種技術。Garrison等在弗吉尼亞州諾福克的拉斐特河和海灣流淌的水中加入大腸埃希氏菌和鞭毛蟲后，采用蔗糖密度梯度離心法實現了對兩種微生物的富集。Chesnot等采用不同惰性介質的密度梯度離心法實現了渾濁水樣中隱孢子蟲卵囊的富集，已發布的生活飲用水規范檢驗方法》GB/T5750-2023中兩蟲檢測中也新增了密度梯度法。Hinzk等使用蔗糖密度梯度離心法根據微生物大小從海水中富集了細菌共生體。
密度梯度離心法的優點：
①分離效果好，可一次獲得雜質較少的目標微生物；②適用范圍廣，既能分離沉降系數不同的顆粒，又能分離密度不同的顆粒；
該法存在局限性：
①成本昂貴；②需要制備惰性介質溶液；③操作復雜，不易掌握。
3過濾法
過濾技術是以壓力作為推動力的一種膜分離技術，膜孔徑范圍從小于2nm大于20μm不等。其分離機理主要有兩種：
1機械篩分，通過膜截留比膜孔徑大或與其孔徑相當的微生物顆粒；
2吸附截留，當微生物穿過膜外表進入膜內部時，利用膜自身的物理化學性質和靜電引力使微生物堆積在膜孔側壁或膜內部基質上。根據膜孔徑大小，過濾技術可被分為微濾、超濾、納濾和反滲透，微生物前處置過程中主要采用微濾和超濾技術。
4磁性分離法
磁性分離是以磁性或可磁化的資料作為吸附劑的一種分離富集技術。大多數應用于分離的磁性資料具有超順磁性，即在通常情況下沒有磁力，外加磁場下可表示出磁性。重慶純水設備沒有磁場的情況下可以充沛地分散在溶液中，與目標物結合，之后在外加磁場下聚集于容器一側，通過棄去溶液和重復洗滌來最大限度地去除抑制物。磁性資料只是載體，只有對磁性納米資料（MagnetNanoparticlMNP進行外表修飾，使其具有抗體、抗生素（萬古霉素、達托霉素等）和化合物等識別基團才干捕捉目標微生物。
4.1免疫磁分離法
免疫磁分離是指用抗體修飾MNP基于抗體-抗原相互作用從水體中選擇性捕捉目標微生物。Guven等用IgE標志的免疫磁珠分離水樣中的大腸埃希氏菌，結合免疫分析技術進行檢測，檢出限為8CFU/mLQuang等用蛋白A偶聯殼聚糖修飾的Fe3O4磁性顆粒結合IgG抗體從濃度低至10CFU/mL水樣中分離出了霍亂弧菌。國施行的生活飲用水規范檢驗方法 微生物指標》GB/T5750.122023規定采用免疫磁分離熒光抗體法測定生活飲用水及其水源水中的賈第鞭毛蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊。Villamizar-Gallardo等使用抗輪狀病毒單克隆抗體功能化氟磁性納米粒子實現了對水中輪狀病毒的富集。
4.2基于抗生素修飾的磁性分離法
一些抗菌物質能夠抗菌是因為能與致病菌外表的一些生物結構相互結合，利用這一特點將其與磁性粒子結合可以起到捕捉細菌的作用。Meng等用萬古霉素修飾的MNP捕捉水、牛奶和果汁飲料中的金黃色葡萄球菌，結合流式細胞儀，檢出限為33CFU/mLDing等用抗菌肽功能化磁性納米顆粒在較低濃度下（0.1mg/mL實現了對致病性革蘭氏陰性桿菌的半選擇性捕捉，較高濃度下（0.5mg/mL實現了對自來水和休閑水中大腸埃希氏菌的高效捕捉，捕捉效率大于97%
4.3其他
除了基于抗體和抗生素修飾的分離磁珠之外，還有一些其他經過化合物改性的磁珠被用于致病菌、病毒分離。Zhan等制備了一種新型的胺功能化磁性Fe3O4-SiO2-NH2納米粒子，可捕獲水中的病毒（脊髓灰質炎病毒1和致病菌（金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌O157:H7銅綠假單胞菌、沙門菌和枯草桿菌）回收率為92%~96.3%Huang等報道了用胺基修飾的硅包Fe3O4磁性納米粒子分離水和飲料中的大腸埃希氏菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌等多種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，平均回收率達到88.5%~99.1%Bohara等用功能化鐵酸鈷納米顆粒基于疏水作用捕捉水樣中的革蘭氏陰性菌（大腸埃希氏菌）和革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）平均回收率分別為65%和95%雖然這些化合物修飾的MNP無法特異性的區分某個特定的種屬或者菌株，但這種廣泛性是抗體和抗生素等識別片段無法比較的因此這類磁珠的研究與開發也會是未來的熱點方向之一。
以上各種磁性分離方法的優缺點匯總見下表，總的來說，磁性分離在致病菌和病毒前處置方面具有很大優勢，可以快速有效地去除干擾物的同時富集目標微生物，無論是與分子檢測方法還是其他檢測方法結合都具有巨大的潛力，但局限在于其在水中原蟲的富集應用較少，此外，影響其穩定性因素多。
表 各種磁性分離方法的優缺點匯總
水體致病微生物檢測中樣品前處理方法
研究結論
水體致病微生物污染可對人類和動物造成危害，引發介水傳染病，而水體中致病微生物濃度低、基質復雜，對水樣進行充沛的前處置可以提高水體中致病微生物的檢測能力； 重慶純水設備
從現有研究來看，常用的前處置方法主要包括富集培養法、離心法、過濾法、磁性分離法等；
各種水樣前處置方法各有特點，應用過程中可根據不同方法的優缺點和適用范圍針對性進行選擇；
基于現有前處理方法的缺乏，未來研發的重點應該是最大可能排除雜質干擾的基礎上努力減少前處置過程中目標微生物的損失，如開發水體雜質去除方法、開展水體中致病微生物的二次富集等，為實現水源性致病微生物高效、快速的檢測及水源性疫情爆發早期預警提供基礎。
表 水體致病微生物前處理方法的優缺點及其適用范圍
水體致病微生物檢測中樣品前處理方法
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